【摘 要】
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背景:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心血管疾病主要病理基础,其发生发展与巨噬细胞息息相关。脂肪量与肥胖相关基因（FTO）作为第一个m~6A m RNA去甲基化酶的发现确立了可逆RNA修饰的概念,FTO是主要m~6A“橡皮擦”之一。N6甲基腺苷（N6-methyladenosine,m~6A）修饰影响脂质代谢过程,与人体脂质紊乱疾病进展有关。作为真核生物信使RNA（m RNA
【基金项目】
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国家自然科学基金项目,项目批准号:82160098；
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背景:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心血管疾病主要病理基础,其发生发展与巨噬细胞息息相关。脂肪量与肥胖相关基因（FTO）作为第一个m~6A m RNA去甲基化酶的发现确立了可逆RNA修饰的概念,FTO是主要m~6A“橡皮擦”之一。N6甲基腺苷（N6-methyladenosine,m~6A）修饰影响脂质代谢过程,与人体脂质紊乱疾病进展有关。作为真核生物信使RNA（m RNA）最丰富的表观遗传修饰,m~6A在底物m RNA包括脂质相关基因m RNA代谢的调节中起关键作用。脂质摄入调节因子1（lipid uptake regulator 1,LUR1）是一种新型促脂质生成调节因子,分布于脂质代谢相关组织中。研究发现LUR1通过调节SREBPs m RNA加工促进SREBP靶基因表达,促进肝细胞内胆固醇积累,进而上调细胞内胆固醇水平。目前关于LUR1在巨噬细胞中的表达调控机制研究鲜有报道,因此进一步探讨调控LUR1表达分子机制对巨噬细胞脂质代谢的影响显得尤为重要。前期生物信息学分析发现LUR1 m RNA含有多个m~6A甲基化修饰位点;提示m~6A修饰可能通过靶向调节巨噬细胞LUR1水平,影响巨噬细胞脂质含量,进而影响AS的发生发展。目的:探讨FTO催化LUR1 m RNA去m~6A修饰影响巨噬细胞脂质蓄积及主动脉AS病变的作用及分子机制。方法:100ng/ml PMA（佛波酯）诱导THP-1细胞贴壁后,100μg/m L ac-LDL孵育THP-1源性细胞。然后,Western blot测定FTO和LUR1蛋白。SRAMP,RMBase和m~6AVar网站分析LUR1 m RNA上m~6A修饰位点情况。q PCR检测细胞过表达质粒FTO、LUR1和si-FTO RNA转染情况。ELISA检测巨噬细胞脂质含量。油红O染色观察巨噬细胞脂滴情况。Me RIP-q PCR检测LUR1 m~6A修饰水平。上调apo E-/-小鼠FTO和LUR1表达,组织冰冻切片免疫荧光染色方法检测斑块内FTO和LUR1表达,组织冰冻切片染色检测小鼠主动脉窦处斑块面积和血管脂质沉积情况;生化检测apo E-/-小鼠血浆脂质谱水平。结果:通过GEO分析发现在正常动脉组织及动脉斑块组织中FTO和LUR1的表达存在差异,且两者在斑块组织中的表达存在负性相关关系。分别用50μg/ml和100μg/ml ac-LDL孵育THP-1细胞48h后WB和q PCR检测发现FTO表达下降后上升;LUR1蛋白表达在50μg/ml ac-LDL孵育下无明显变化,m RNA水平降低,100μg/ml ac-LDL孵育后无明显变化,初步确定FTO和LUR1可能与巨噬细胞荷脂存在关联。与OE-NC组相比,过表达FTO之后其蛋白和RNA水平均上调,而LUR1蛋白水平出现明显下降,油红O染色和ELISA检测显示细胞内脂滴和胆固醇酯含量减少。反之,转染FTO干扰RNA后通过WB和q PCR筛选发现,si-FTO-1为干扰效果最佳链;与si-NC组相比,转染si-FTO-1组FTO蛋白及其RNA水平出现明显下调,LUR1的蛋白表达明显上调,油红O染色和ELISA实验结果显示细胞内脂质含量明显增加;与OE-FTO组相比,过表达FTO同时过表达LUR1后检测到LUR1蛋白水平出现逆转。在网站预测到LUR1存在大量的甲基化位点及与YTHDF1结合的位点;与对照组相比,m~6A检测试剂盒发现FTO过表达组的总甲基化水平下降,而FTO干扰组总甲基化水平上升;Me RIP-q PCR分别检测转染OE-FTO或si-FTO干预之后LUR1 m~6A修饰水平,结果表明FTO过表达后LUR1甲基化水平下降,干扰FTO后LUR1甲基化修饰水平出现逆转。在高脂喂养apo E-/-小鼠中,与Vehicle组相比,AAV-FTO组主动脉及其分支处、主动脉窦冰冻切片斑块面积均明显较少,共注射AAV-LUR1组小鼠主动脉及分支处斑块面积出现逆转;免疫组织化学结果显示AAV-FTO及AAV-FTO+AAV-LUR1组小鼠的斑块内FTO表达较Vehicle组明显升高,而AAV-FTO组小鼠斑块内LUR1蛋白水平较低,但AAV-FTO+AAV-LUR1组小鼠斑块内LUR1蛋白水平出现逆转。结论:FTO催化去m~6A修饰下调LUR1表达,抑制巨噬细胞脂质蓄积及主动脉AS病变的发生发展。
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